人肌腱胶原蛋白的提取及凝胶制备 2005年 03月第 22卷第 03期 Prac J Med& PharmNol 22，2—005-03—No．03 人肌腱胶原蛋白的提取及凝胶制备 木 吴国选 伍津津 朱堂友 鲁元刚 毕建军 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科，重庆 400042) 【摘 要1 目的 探索人肌腱胶原蛋白在组织工程皮肤及整形外科中的应用。方法 从人肌腱提取酸溶 性胶原，制备人肌腱胶原蛋白。结果 所提取的胶原在 pH5，8左右迅速形成凝胶。光镜下可见酸溶性胶原 纤维呈长细丝状，交织成网状。纯度以羟脯氨酸质量分...

  2005年 03月第 22卷第 03期 Prac J Med& PharmNol 22，2—005-03—No．03 人肌腱胶原蛋白的提取及凝胶制备 木 吴国选 伍津津 朱堂友 鲁元刚 毕建军 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科，重庆 400042) 【摘 要1 目的 探索人肌腱胶原蛋白在组织工程皮肤及整形外科中的应用。方法 从人肌腱提取酸溶 性胶原，制备人肌腱胶原蛋白。结果 所提取的胶原在 pH5，8左右迅速形成凝胶。光镜下可见酸溶性胶原 纤维呈长细丝状，交织成网状。纯度以羟脯氨酸质量分数为基准，分光光度法测定为95％。氨基酸成分主 要为甘氨酸占35％，脯氨酸占10％。结论 氨基酸分析表明，所提取的胶原为典型的 I型胶原蛋白，热稳 定性测定 Td为 39—4l℃。 【关键词】 人肌腱 胶原蛋白 提取 凝胶制备 【中图分类号】 Q5；Q7；R337 【文献标识码】 A Extraction and gel preparation of human tendon collagen WU Guoxuan，wu Jinjin，ZHU Tangyou，et al， Daping Hospital，Research Institute of Field Surgery,Third Military Medical University，Chongqing 400042，China 【Abstract】 0bjective To investigate the use of human tendon coUagen in tissue engineered skin and plastic surgery．M ethod A new technology for extraction of acid-resolved collagen from human tendon Was studied in this paper，ie， 0．I％HAc solution was used as solvent to refine human tendon coUagen． Results The extracted coUagen can be able to form coUagen gel immediately at pH5，8．Th e morphology of the coUage gel under a light microscope was follows：the acetic acid—resolved collagen fibrils were long，straight and thin ．Th e purity of collagen was 95％ based on the hydroxyproline content determined by UV．Th e component of amino acid was mainly aminoacetic acid reaching 35％，proline reaching 1 0％． Conclusion From amino acid analysis，it is concluded that the extracted collagen is typical I type collagen，Determ ination of therm al stability of collagen expressed as Td is 39—41℃． 【Key words】 Human tendon Collagen Extraction Gel preparation 胶原(collagen)是动物体中最广泛存在的蛋白 质，在哺乳动物体内含量约为其体重的25％。在真 皮中胶原的质量分数甚至可达 85％。由于胶原分子 内及分子间存在氢键作用、分子间吸引力和一定的 化学键交联，从而使胶原具备极高的机械强度⋯。胶 原的这一特点以及它具有其它高分子材料无可比 拟的生物相容性和生物降解性，使它作为天然高分 子材料，在生物医学领域和智能生物材料制备等方 面获得了广泛的应用 ]。I型胶原蛋白主要存在于 皮肤、肌腱和韧带中。胶原可由两种方法提取：一是 对其生物分子结构进行处理 ，去除无关物，减少杂 物，得到胶原分子主要成分。此法易行，且获得胶原 蛋白量大。二是完全破坏胶原结构、将其重新组成 预定之产品。此法复杂、费用高、产量低【516／。本实验 选用前法，即用稀的冰醋酸溶液 (0．17～0．5mol，pH ’国家自然科学基金资助项目．No．39870238 吴国选 ，男 ，1970年出生 ，硕士 ，主治医师；电线．O)溶解和提取出没有交联的胶原分子 ．有选 择地从截肢术标本肌腱中提取较纯的 I型人胶原 蛋白。 1 材料和方法 1．1 可溶性人肌腱胶原蛋 白的提取 取外科截肢 术标本 ，取出其中肌腱，去除脂肪组织，清理洗涤干净， 切成 3．0cmx0．5cm小条，浸渍在 1NNaOH中，温度 为 15℃左右，时间 15～30d。待肌腱完全膨胀至晶莹 透亮 ，取出，用水充分洗涤 ，至 pH 9．0左右 ，再用 1N HC1中和至中性，然后将膨胀后的人肌腱置 75％乙醇中浸泡 30min消毒，取出后以 D—Hanks液 冲洗，至少 5遍以上。称取约 10g，用剪刀剪碎至糊 状，放入锥形瓶内，加入 0．1％冰醋酸500ml、胃蛋白 酶 100mg，振荡，置4℃冰箱内4d，定时振荡 4-6次／ d。4d后高速低温离心 1h(2 O00r／min)，以去除不溶 解的碎片，其上清液即为液态粗制胶原。在粗制胶 原液中加入 NaC1至 2mol浓度，胶原即以白色絮状 沉淀析出，以生理盐水清洗沉淀物数遍后，再加入 维普资讯 医药杂志2005年03月第 鲞筮 Q 塑 』丛 鱼 ： 丝! = ： 生理盐水离心沉淀 ，4 000r／min离心 10min，2次，弃 去上清液。将胶原再次溶解于0．1％冰醋酸中，即为 精制的液态胶原，置 4~C冰箱中保存。 1．2 人肌腱胶原凝胶的制备 取提取的人肌腱胶 原 10ml至培养皿中，用 1NNaOH调节其 pH值至 5．8左右 ，人肌腱胶原即迅速形成胶原蛋 白凝胶。 1．3 胶原蛋白的鉴定 氨基酸含量分析仪器为日 立 835—50型氨基酸自动分析仪；紫外分光吸收检 验仪器为日立 Uv一210分光光度计 ABSO一2；胶原 蛋白浓度测定仪器为 Kjeleol030自动分析仪。 1．4 胶原纯度测定 采用分光光度计法通过测定 胶原中羟脯氨酸含量来计算所提取胶原的纯度。 2 结 果 2．1 胶原的鉴定 共提取人肌腱胶原 4批，将所得 精制胶原标本做氨基酸含量分析及紫外分光吸收 检验。①氨基酸含量分析结果：甘氨酸占氨基酸总 量的 35％，脯氨酸占10％，符合胶原蛋白的

  ；② 紫外分光吸收检验结果：如图 1所示，标本中的胶 原蛋白在 230nm波长下呈强烈的光吸收，符合胶原 蛋白的特性 。 图 1 胶原紫外分光吸收光谱 2．2 胶原蛋白浓度的测定 应用微量凯氏 (Kie— ldah1)定氮法，对标本进行胶原浓度的测定，结果为 4．Omg／ml。 2，3 胶原蛋白纯度的测定 根据羟脯氨酸仅存在 于胶原、弹性蛋白和伸展蛋白中，而不存在于一般 蛋白质中的文献报道17]。其在胶原中的含量为胶原 氨基酸总质量的 10％。因而可通过测定胶原中羟脯 氨酸的含量来确定胶原的纯度。经测定所提取的胶 原的纯度为 95％。 2．4 胶原凝胶的观察及评价 将用 1NNaOH调节 其 pH值至 5．8左右，人肌腱胶原迅速凝固形成胶 原凝胶。刚制成的胶原凝胶为无色透明的胶状物 ， 与培养皿紧密附着，不易松脱。用探针探及凝胶．较 柔软 ，有一定的抗张力性能 ．可将凝胶分成细小的 凝胶碎片。光镜下见凝胶由相互交织的胶原原纤维 构成立体的网状结构．表面平整．网孔直径大小较 均匀 ，均为 0．1～0．51xm。所提取的胶原置 39～41℃恒 温箱中迅速变性。 3 讨 论 胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，约占人 体蛋白质总量的 30％以上。它遍布于体内各种器官 和组织，可由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞及某 些上皮细胞合成并分泌到细胞外。胶原的研究较透 彻的为 I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及V型胶原。I～Ⅲ型胶原为缝 隙胶原，以长度及粗细不等有横纹的纤维束形式存 在。I型胶原常形成粗大的纤维束，分布广泛，主要 存在于皮肤、肌腱、韧带及骨中，具有比较强的抗张强 度。肌腱中主要含有 I型胶原 ；软骨 中主要含有 Ⅱ 型胶原：皮肤、』fIL管壁和各种软组织器官的间质中 则同时含有 I型和Ⅲ型胶原；Ⅳ型胶原仅存在于基 膜中：V型胶原则分布在细胞的外周【71。由此可见， 皮肤的胶原为 I型和Ⅲ型胶原。我们所提取的胶 原，从原料、提取方法和氨基酸分析来看 ，主要为 I 型胶原。 本 研 究 提 取 的 皎 原蛋 白中甘 氨 酸 含 量 为 33．78％，约占氨基酸总量的 1／3以上，羟氨酸约占 氨基酸总量的 10％，羟脯氨酸与脯氨酸之比为 0．68。可见，本胶原提取物氨基酸组成符合 I型胶原 的组成特点。本实验制备的人肌腱胶原蛋白，主要 成分为 I型胶原，其抗原性低：经 72h恒温培养箱 内培养无细菌生长：用紫外分光光计测定，其吸收 高峰为 230nm；经分析主要为甘氨酸．占35％、脯氨 酸占 l1％：凯氏定氮法浓度为 4．0mg／ml。此胶原液 在pH 5．8左右即形成凝胶，在 39～41℃恒温箱中迅 速变性。光镜下见凝胶由相互交织的胶原原结构构 成立体的网状结构。这种结构相似于机体内胶原的 结构，对于体外培养的细胞起着锚定和支持作用，并 为细胞增殖生长提供适当的微环境191 由于胶原蛋白 的成凝胶性、成固体性，可作为生物医用材料，用于 整形外科一软组织充填材料及粘接剂等方面 IlO．1ll。 目前胶原的提取多集中在相对易于处理的牛 腱和鼠尾腱 2 l 胶原蛋白的提取方法主要有酸溶 解法和酶降解法。酸溶解法可将没有交联的胶原分 子溶解提取出来．也可溶解含有醛胺类交联的胶原 纤维，因为这类交联键在酸性条件下不稳定。但当 用酸溶解法提取成年动物组织中的胶原时 ．只能提 取出 I型胶原。酶降解法则可将胶原分子中两端非 杆状三螺旋结构里的肽链水解．末端肽亦被切割下 来。由于胶原分子间的共价交联键都是通过分子末 端肽里的赖氨酸或羟赖氨酸的相互作用形成．故末 端肽被切割后 ．大约 70％～80％近似完整的胶原分 子便能从胶原分子中解聚出来而被提取。 雷 曲∞辐∞ ∞ 0 0o0甚]馨 爨 末杯 维普资讯 年 03月第 22卷第 03期 Prac J Med＆ Pharm．Vol 22，2 5—0 v．O 03 王韦【l4噌报道酸溶解法提取猪皮胶原。我们所 采用的是碱溶胀结合酶降解法，碱溶胀可除去肌腱 中的污物，使其容易溶断，并能引起胶原分子的变 化，经碱处理后胶原纤维吸水膨胀疏松、张开、内部 结合力减弱，胶原纤维在 pH 12．2时溶胀程度最 大。从效果来看，所提取的胶原液浓度高，比单纯的 酸溶解法效果好，且不论成年动物或幼年动物肌腱 胶原的提取均可采用此法。胶原作为一种细胞外间 质，是真皮再造最基本的生物材料，因其抗张强度 和弹性较高，而免疫原性很低，近年来作为一种新 的生物材料大范围的应用于1临床，国内外将其用作组织 工程皮肤的支架材料。 胶原蛋白的鉴定l 51除我们所采用的氨基酸含量 分析和紫外分光吸收检验和凯氏定氮法定量的方 法外，还有羟脯氨酸含量测定、SDS一聚丙烯酰胺凝 胶电泳、变性条件下的胶原柱层析、溴化氢降解胶 原及其肽图等，因限于条件，未能进行，因此难以对 标本中各型胶原的性质和含量作进一步的分析。 参考文献 1 甘景镐，甘纯玑，胡炳环．天然高分子化学．北京：高等教育出版社， l993．71-74 2 刘自玲．胶原在生物医学领域的应用．皮革科学与工程，1999。9 (3)：35 3 Miyata T,Taira T．Noishiki Y．Collagen engineering for biomaterial · 229· use．Clinical Materials，1992，c9)：139 4 沈 锋．杨丽芳。成国祥．等．智能高分子材料的研究进展．材料研 究学报 ，2000，14(1)：1 5 FranK MK．Clinical use of injectable collagen．Arch Otolangryo1． 1984．1 10：93 6 李玉瑞．细胞外间质的生物化学及研究方法．北京：人民卫生出 版社 。1988．174—178。184—192 7 永井裕．藤本大本郎编著刘平译．胶原蛋白实验方法．上海：上海 中医学院出版社．1992．31 8 Robert M and Hoffnan．Three-dimensional histcuhure：Origins and application in cancer research．Cancer Cells，1991,3(3)：86 9 罗 磊．医用胶原和羟基磷灰石一胶原复合材料的实验研究．华 西医科大学博士研究生学位论文。1995 10 Burgess LP，Coode RL．1nsectable collag en．Facial Plast Surg． 1992．8：176 ll 吴志谷，盛志勇，孙国柱，等．几种胶原型刨伤敷料制作的实验研 究．生物医学工程学杂志。1999，16(2)：147 12 Davison PF．Collagen Extracted from Animal CoHag en—-contain—- ing Tissue．US：5 064 941．1991-05-20． 13 李孝建，史济湘．人工线一硫酸软紊膜的制作及部分 性能测定．生物医学工程学杂志，1999，16(2)：151 14 王 韦．应用胶原膜作底物培养人表皮细胞和移植的初步报告． 第二军医大学学报，1988，9：1 16 l5 肖建德．胶原的生物化学特性及其在外科的应用．国外医学刨 伤与外科基本问题分册，1987，(2)：75 【收稿日期：2004—11-08】 【本文编辑：韩仲琪 王庆法】 ·短篇园地· 病历对外复印应注意几个问题 刘召平 李晓娓 冷文玉 方瑞燕 (总 医院病案室，山东济南 250031) 【中图分类q-] R197．323 【文献标识码】 B 国家卫生部颁布的《医疗事故处理条例》，给医院病案管 理工作提出了新的要求，新的压力。怎么样才能做好病历的复印工 作是我们每个病案管理人员义不容辞的

  归纳如下： 病历复印的最大的目的：①患者本人和家属：其主要 目的 是保存病历资料，已备复诊、会诊等有关健康情况使用．或者 报销、评残、病退以及司法等情况应用；②司法单位：为调查 案件准备资料；③医疗保险：主要了解投保者病情、住院费用 及健康情况，以确定理陪金额；④单位有关人员：主要了解患 者病情、住院费用和健康情况，以确定报销金额；⑤卫生行政 职能部门：主要了解当地医疗卫生情况以便制定各项工作规 定与措施 。 病历对外复印应注意的几个问题 ：①复印内容、时问和 批准部门：住院患者出院 3d(死亡病历 7d)后，方可办理查 阅、复印，复印病历须经医务部(处)批准，复印内容按国家卫 生部制定的

  》执行；②复印本人病 例：复印患者本人病历，需持本人身份证、住院收据或其他住 院证明，并说明复印目的；③复印他人病历：复印、查阅、咨询 他人病历时应出具患者的委托同意书、患者门诊病历或患者 住院收据、患者及授权人身份证(原件)，同时应提供有关证 明；到外院就诊需要用原就诊病历资料时，应提供患者在 该医疗机构的就诊证明；律师为案件目的需要用病历时， 必须出示法院立案证明、单位证明及个人身份证明：商业医 疗保险人需要了解患者情况时，需要出示保险机构证明： 公、检、法人员在执行公务中需要用病历时须出示单位证 明、立案证号及两位工作人员身份证明；④特殊病历的复印： 凡涉及医疗纠纷或封存病历。需在各级医疗鉴别判定部门或人民 法院受理并同意拆封后，方可办理：凡涉及党和国家机密的 病历，须经上级卫生行政部门及主管院领导或医务部领导批 准，方町对外复印。 【收稿 日期：2004—12—091 【本文编辑 ：羡秋盛】 维普资讯

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